स्टीविया रेबाडियोसाइड डी की उच्च उपज प्राप्त करने के लिए प्रतिक्रिया स्थितियों का अनुकूलन
उच्च चीनी वाले आहार ने मोटापा, मधुमेह, हृदय रोग और उच्च रक्तचाप सहित विभिन्न पुरानी बीमारियों के बढ़ते प्रसार को जन्म दिया है, जो एक महत्वपूर्ण वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता पैदा कर रहा है। स्टीविया रेबाडियोसाइड डी (रेब डी), पौधों से प्राप्त एक प्राकृतिक स्वीटनर, ने अपनी शून्य-कैलोरी सामग्री, तीव्र मिठास और मनभावन स्वाद प्रोफ़ाइल के कारण चीनी विकल्प के रूप में महत्वपूर्ण ध्यान आकर्षित किया है।
हालांकि, स्टीविया रिबौडियाना बर्टोनी में इसकी सीमित उपस्थिति और पौधे-व्युत्पन्न ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ की कम घुलनशीलता और एंजाइमेटिक गतिविधि से संबंधित चुनौतियों ने इसके व्यापक व्यावसायिक अनुप्रयोग में बाधा उत्पन्न की है। इन मुद्दों के जवाब में, बैसिलस सबटिलिस 168 से उत्पन्न होने वाले YojK नामक एक उपन्यास ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ की खोज की गई थी। यह अध्ययन आनुवंशिक रूप से संशोधित बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़, YojK-I241T/G327N का परिचय देता है, जो उच्च घुलनशीलता और उत्प्रेरक दक्षता की विशेषता है, जो रेब डी के औद्योगिक पैमाने पर उत्पादन के लिए काफी क्षमता प्रदान करता है।
YojK-I241T/G327N और AtSuSy एंजाइमों की कैस्केड प्रतिक्रिया का उपयोग करके रिबाडियोसाइड डी के उत्पादन के लिए एक अत्यधिक कुशल विधि का विकास।
पौधे-व्युत्पन्न ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ में कम घुलनशीलता के मुद्दे को हल करने के लिए, शोधकर्ताओं ने YojK का उपयोग करने की क्षमता की जांच की, जो बैसिलस सबटिलिस 168 से एक ओ-ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ है। YojK को बड़े अणुओं सहित विभिन्न सबस्ट्रेट्स के साथ इसकी प्रदर्शित ग्लाइकोसिलेशन गतिविधि के कारण चुना गया था। सफल पुनः संयोजक अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण के बाद, YojK को ग्लाइकोसाइलेट रेब ए के लिए नियोजित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप स्टीविया रेब डी का उत्पादन हुआ। एंजाइम गतिज विश्लेषण से पता चला कि YojK में अन्य ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ की तुलना में Reb D की ओर कम उत्प्रेरक गतिविधि है। नतीजतन, अध्ययन संभावित व्यावहारिक अनुप्रयोगों के लिए YojK की उत्प्रेरक गतिविधि को बढ़ाने के लिए संरचना-निर्देशित इंजीनियरिंग की आवश्यकता का सुझाव देता है। (जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है)
चित्रा 1
रिबॉडियोसाइड डी की उच्च उपज प्राप्त करने के लिए प्रतिक्रिया स्थितियों का अनुकूलन।
पीएच, तापमान और सब्सट्रेट सांद्रता सहित प्रतिक्रिया की स्थिति को स्रेविया रेब डी की उच्च उपज प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अध्ययन में यह जांचने के लिए आणविक गतिशीलता सिमुलेशन का उपयोग किया गया कि कैसे YojK-I241T/G327N संस्करण Reb D ग्लाइकोसिलेशन को बढ़ाता है। वैरिएंट ने सिमुलेशन के दौरान रेब ए और एच 14 के बीच एक स्थिर हाइड्रोजन बंधन बनाए रखा, जंगली-प्रकार के विपरीत (जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है)। यह स्थिरता रेब ए के O2 परमाणु और UDPG के C1P के बीच की दूरी तक भी फैली हुई है। YojK-I241T/G327N वैरिएंट की बेहतर उत्प्रेरक दक्षता को इन स्थिर इंटरैक्शन के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था, जो इसकी व्यावहारिक क्षमता का सुझाव देता है।
चित्रा 2
चित्रा 3
निष्कर्ष
इस दृष्टिकोण से 83.47% रेब डी प्राप्त हुआ। विशेष रूप से, 1 मिमी यूडीपीजी जोड़ने से 20.59 ग्राम/एल रेब डी के संश्लेषण को उल्लेखनीय 91.29% उपज के साथ अनुमति मिली, जो पिछले अध्ययनों से आगे निकल गया। यह प्रक्रिया औद्योगिक पैमाने पर आरईबी डी उत्पादन की क्षमता को प्रदर्शित करती है, विशेष रूप से YojK की संरचनात्मक इंजीनियरिंग के बाद।YojK को उच्च घुलनशीलता के साथ E. coli BL21 (DE3) में कुशलतापूर्वक व्यक्त किया जा सकता है। संरचना-निर्देशित इंजीनियरिंग के माध्यम से, एक डबल म्यूटेंट, YojK-I241T/G327N बनाया गया था, जो सुक्रोज सिंथेज़ AtSuSy द्वारा उत्प्रेरित UDPG को रीसाइक्लिंग करके 91.29% की असाधारण उपज के साथ Reb D के बड़े पैमाने पर उत्पादन को सक्षम बनाता है। यह अध्ययन YojK-I241T/G327N को आर्थिक रूप से प्रभावी औद्योगिक पैमाने पर Reb D उत्पादन के लिए एक आशाजनक उपकरण के रूप में प्रस्तुत करता है।
