优化反应条件以实现甜菊糖苷D的高产率
उच्च-चीनी आहार ने मोटापा, मधुमेह, हृदय रोगों और उच्च रक्तचाप सहित विभिन्न पुरानी बीमारियों के बढ़ते प्रसार को जन्म दिया है, जो एक महत्वपूर्ण वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता पैदा कर रहा है। स्टीविया रेबाउडियोसाइड डी (रेब डी), पौधों से प्राप्त एक प्राकृतिक स्वीटनर, अपनी शून्य-कैलोरी सामग्री, तीव्र मिठास और सुखद स्वाद प्रोफ़ाइल के कारण चीनी विकल्प के रूप में महत्वपूर्ण ध्यान आकर्षित किया है।
हालांकि, स्टीविया रेबाउडियाना बर्टोनी में इसकी सीमित उपस्थिति और पौधे-व्युत्पन्न ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ की कम घुलनशीलता और एंजाइमेटिक गतिविधि से संबंधित चुनौतियों ने इसके व्यापक व्यावसायिक अनुप्रयोग में बाधा उत्पन्न की है। इन मुद्दों के जवाब में, बैसिलस सबटिलिस 168 से उत्पन्न एक नया ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़, जिसे YojK कहा जाता है, की खोज की गई। यह अध्ययन एक आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवाणु ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़, YojK-I241T/G327N, का परिचय देता है, जो उच्च घुलनशीलता और उत्प्रेरक दक्षता द्वारा विशेषता है, जो रेब डी के औद्योगिक पैमाने पर उत्पादन के लिए महान क्षमता प्रदान करता है।
YojK-I241T/G327N और AtSuSy एंजाइमों के कैस्केड प्रतिक्रिया का उपयोग करके रेबाउडियोसाइड डी के उत्पादन के लिए एक अत्यधिक कुशल विधि का विकास।
पौधे-व्युत्पन्न ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ में कम घुलनशीलता के मुद्दे को संबोधित करने के लिए, शोधकर्ताओं ने बैसिलस सबटिलिस 168 से YojK, एक O-ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़, का उपयोग करने की क्षमता की जांच की। YojK को चुना गया क्योंकि इसने बड़े अणुओं सहित विभिन्न सब्सट्रेट्स के साथ ग्लाइकोसिलेशन गतिविधि प्रदर्शित की थी। सफल पुनः संयोजक अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण के बाद, YojK को रेब ए को ग्लाइकोसिलेट करने के लिए नियोजित किया गया, जिसके परिणामस्वरूप स्टीविया रेब डी का उत्पादन हुआ। एंजाइम काइनेटिक विश्लेषण से पता चला कि YojK में अन्य ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ की तुलना में रेब डी के प्रति कम उत्प्रेरक गतिविधि है। परिणामस्वरूप, अध्ययन संभावित व्यावहारिक अनुप्रयोगों के लिए YojK की उत्प्रेरक गतिविधि को बढ़ाने के लिए संरचना-निर्देशित इंजीनियरिंग की आवश्यकता का सुझाव देता है। (जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है)
चित्र 1
रेबाउडियोसाइड डी की उच्च उपज प्राप्त करने के लिए प्रतिक्रिया स्थितियों का अनुकूलन।
प्रतिक्रिया स्थितियों, जिसमें पीएच, तापमान और सब्सट्रेट एकाग्रता शामिल हैं, को स्टीविया रेब डी की उच्च उपज प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अध्ययन ने आणविक गतिशीलता सिमुलेशन का उपयोग यह जांचने के लिए किया कि YojK-I241T/G327N संस्करण रेब डी ग्लाइकोसिलेशन को कैसे बढ़ाता है। संस्करण ने सिमुलेशन के दौरान रेब ए और H14 के बीच एक स्थिर हाइड्रोजन बंध बनाए रखा, जंगली-प्रकार के विपरीत (जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है)। यह स्थिरता रेब ए के O2 परमाणु और UDPG के C1P के बीच की दूरी तक भी विस्तारित हुई। YojK-I241T/G327N संस्करण की बेहतर उत्प्रेरक दक्षता इन स्थिर इंटरैक्शन के लिए जिम्मेदार थी, जो इसकी व्यावहारिक क्षमता का सुझाव देती है।
चित्र 2
चित्र 3
निष्कर्ष
इस दृष्टिकोण ने 83.47% रेब डी प्राप्त किया। विशेष रूप से, 1 mM UDPG जोड़ने से 20.59 ग्राम/लीटर रेब डी का संश्लेषण 91.29% की उल्लेखनीय उपज के साथ संभव हुआ, जो पिछले अध्ययनों से बेहतर है। यह प्रक्रिया औद्योगिक पैमाने पर रेब डी उत्पादन की क्षमता प्रदर्शित करती है, विशेष रूप से YojK की संरचनात्मक इंजीनियरिंग के बाद।YojK को उच्च घुलनशीलता के साथ ई. कोलाई BL21 (DE3) में कुशलतापूर्वक व्यक्त किया जा सकता है। संरचना-निर्देशित इंजीनियरिंग के माध्यम से, एक डबल म्यूटेंट, YojK-I241T/G327N, बनाया गया, जो सुक्रोज सिंथेज़ AtSuSy द्वारा उत्प्रेरित UDPG के पुनर्चक्रण द्वारा 91.29% की असाधारण उपज के साथ रेब डी के बड़े पैमाने पर उत्पादन को सक्षम बनाता है। यह अध्ययन YojK-I241T/G327N को आर्थिक रूप से प्रभावी औद्योगिक पैमाने पर रेब डी उत्पादन के लिए एक आशाजनक उपकरण के रूप में प्रस्तुत करता है।
