रेडॉक्स कॉफ़ेक्टर पुनर्जनन के हेरफेर के माध्यम से विकास-युग्मित एंजाइम इंजीनियरिंग

जैव प्रौद्योगिकी साधनों के माध्यम से अब नवीकरणीय फीडस्टॉक्स से रसायनों की एक विस्तृत श्रृंखला का उत्पादन किया जा रहा है। बायोप्रोसेस इन यौगिकों के कुशल उत्पादन के लिए एंजाइमेटिक कटैलिसीस पर बहुत अधिक निर्भर करते हैं। यह सुनिश्चित करना कि एंजाइम अपने आवश्यक वातावरण में बेहतर प्रदर्शन करते हैं, इसलिए टिकाऊ उत्पादन के लिए उच्च रुचि है।

सब्सट्रेट विशिष्टता, उत्प्रेरक दर और (थर्मो) स्थिरता जैसे गुण कई महत्वपूर्ण कारकों में से हैं जिन्हें कुशल एंजाइम-संचालित बायोप्रोसेस के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह अनुकूलन समय लेने वाला, महंगा और चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और इसलिए विकास-युग्मित चयन के लिए प्रभावी और लागत प्रभावी तरीके हो सकते हैं, वांछनीय विशेषताओं वाले इंजीनियरिंग एंजाइमों की अत्यधिक मांग होती है।

एंजाइम चयन के एक रूप के रूप में विकास-युग्मित चयन का उपयोग करने के फायदे, जिसमें एक एंजाइम की गतिविधि को एक कोशिका के विकास से जोड़ना शामिल है। इस पद्धति का उपयोग उच्च-थ्रूपुट चयन रणनीति के रूप में किया जा सकता है, और इसे या तो यह सुनिश्चित करके प्राप्त किया जा सकता है कि विकास लक्ष्य एंजाइम द्वारा उत्पाद संश्लेषण पर निर्भर है या एंजाइम की गतिविधि को सेल की वैश्विक ऊर्जा स्थिति से जोड़कर प्राप्त किया जा सकता है। सिंथेटिक जीव विज्ञान का उपयोग विकास-युग्मित चयन के लिए उपयुक्त उपभेदों को इंजीनियर करने के लिए किया जा सकता है, और हाल की प्रगति ने रेडॉक्स कॉफ़ेक्टर जोड़े के ऑक्सीकृत या कम राज्यों में कमी वाले इंजीनियरिंग उपभेदों पर ध्यान केंद्रित किया है, जो एंजाइम इंजीनियरिंग प्लेटफार्मों के रूप में काम कर सकते हैं। इन प्लेटफार्मों के उपयोग से बेहतर बायोकैटलिस्ट और बायोप्रोसेस के विकास में तेजी आ सकती है।

कॉफ़ैक्टर ऑक्सोट्रॉफी के माध्यम से विकास युग्मन के लाभ

लिपिड, जैव ईंधन, गैसों, कार्बनिक सॉल्वैंट्स, या बहुलक यौगिकों जैसे कुछ रसायनों के जैवसंश्लेषण में शामिल इंजीनियरिंग एंजाइमों के लिए एक चयन विधि के रूप में कोफ़ेक्टर ऑक्सोट्रॉफी का उपयोग करने के लाभ। यह दृष्टिकोण कई अनूठे लाभ प्रदान करता है, जिसमें सब्सट्रेट या रुचि के उत्पाद से स्वतंत्र रूप से वांछित उत्पाद का चयन करने की क्षमता शामिल है, जिससे बेहतर एंजाइमेटिक गतिविधि का पता लगाना आसान हो जाता है, और बेहतर एंजाइमेटिक गतिविधि का पता लगाने के लिए एक रीडआउट की पेशकश की जाती है। इसके अतिरिक्त, विकास युग्मन प्लेटफार्मों के रूप में कोफ़ेक्टर ऑक्सोट्रॉफ़्स का उपयोग फायदेमंद है क्योंकि माइक्रोबियल चयापचय में रेडॉक्स कॉफ़ैक्टर्स की सर्वव्यापी प्रकृति का मतलब है कि इंजीनियरिंग रणनीतियों को रुचि के अन्य रोगाणुओं के लिए बाद में हस्तांतरणीय किया जा सकता है, और एंजाइमों को सीधे वांछित माइक्रोबियल होस्ट के वातावरण के भीतर इंजीनियर किया जा सकता है। (चित्र 1 के रूप में दिखाया गया है)

चित्र 1: एंजाइम इंजीनियरिंग के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली कई स्क्रीनिंग/चयन तकनीकों की तुलना

एनएडीएच ऑक्सीकरण में कमी वाले म्यूटेंट

एनएडीएच का ऑक्सीकरण ई. कोलाई ऑक्सीजन की उपलब्धता के आधार पर दो मार्गों से हो सकता है। एरोबिक परिस्थितियों में, एनएडीएच मुख्य रूप से एटीपी उत्पन्न करने के लिए श्वसन के माध्यम से ऑक्सीकरण किया जाता है, जबकि अवायवीय परिस्थितियों में, इसे लैक्टेट और इथेनॉल का उत्पादन करने के लिए किण्वन मार्गों के माध्यम से ऑक्सीकरण किया जा सकता है। के उत्परिवर्ती उपभेदों ई. कोलाई, अवायवीय विकास के दौरान एनएडीएच ऑक्सीकरण के लिए मिश्रित किण्वन मार्गों का उपयोग करने में असमर्थ, का उपयोग विभिन्न रसायनों के अवायवीय संश्लेषण के लिए एनएडीएच ऑक्सीकरण मार्गों को चलाने के लिए किया गया है, जैसे कि 2-मिथाइलप्रोपैन-1-ओएल, 2,3-ब्यूटेनडियोल, 1-ब्यूटेनॉल, और एल-अलैनिन। इन उत्परिवर्ती उपभेदों का उपयोग समान रेडॉक्स सिद्धांतों का दोहन करके एंजाइमों को इंजीनियर करने के लिए भी किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप बेहतर वेरिएंट सामने आए हैं। परिणामी उपभेदों का उपयोग अन्य एनएडी (पी) एच-निर्भर एंजाइमों और मार्गों को इंजीनियर करने के लिए किया जा सकता है।

NAD+ कमी में म्यूटेंट की कमी  

वेंक एट अल ने डायहाइड्रोलिपॉयल डिहाइड्रोजनेज (एलपीडी) जीन को हटाकर ई. कोलाई स्ट्रेन बनाया, जिसके परिणामस्वरूप पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज गतिविधि की अनुपस्थिति के कारण तनाव एसीटेट चयापचय से कम करने वाली शक्ति (एनएडीएच और एनएडीपीएच) उत्पन्न करने में असमर्थ हो गया। इसने एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में एसीटेट पर एरोबिक रूप से उगाए जाने पर शक्ति को कम करने के लिए ऑक्सोट्रॉफी प्रदर्शित करने के लिए तनाव का कारण बना। (चित्र 2 के रूप में दिखाया गया है) तनाव एसीटेट पर बढ़ने में सक्षम था जब ऊपरी ग्लाइकोलाइटिक सबस्ट्रेट्स के साथ पूरक किया जाता है या जब एनएडी + पर निर्भर फॉर्मेट-, इथेनॉल- या मेथनॉल डिहाइड्रोजनेज को उनके संबंधित सबस्ट्रेट्स के साथ व्यक्त करते हैं। स्ट्रेन का उपयोग एंजाइम इंजीनियरिंग के लिए नहीं किया गया था और केवल रेडॉक्स कोफ़ेक्टर ऑक्सोट्रॉफी के लिए मूल्यांकन किया गया था।
 

चित्र 2: केंद्रीय चयापचय 

एनएडीपीएच ऑक्सीकरण में कमी वाले म्यूटेंट

प्रेरित करने के लिए दो अलग-अलग रणनीतियाँ हैं एनएडीपी + ऑक्सोट्रॉफी में ई कोलाई, एनएडीपीएच को ओवरप्रोड्यूस करने के लिए ग्लाइकोलाइटिक मार्ग की इंजीनियरिंग पर निर्भर करती है। पहली रणनीति में देशी गैपए जीन को हटाना और एक विषम एनएडीपी+-निर्भर जीएपीडीएच एंजाइम को व्यक्त करना शामिल है, जबकि दूसरी रणनीति में पेंटोस फॉस्फेट मार्ग के माध्यम से कार्बन प्रवाह को पुनर्निर्देशित करना शामिल है। परिणामी उपभेद ग्लूकोज पर बढ़ने में असमर्थ होते हैं, लेकिन विभिन्न परिस्थितियों में विकास प्रदर्शित करते हैं, पहला तनाव अवायवीय परिस्थितियों में उगाया जाता है और दूसरा सब्सट्रेट के रूप में ग्लिसरॉल के साथ एरोबिक परिस्थितियों में उगाया जाता है। इन उपभेदों का उपयोग बेहतर गुणों वाले इंजीनियरिंग एंजाइमों के लिए किया जाता है, जिसमें सब्सट्रेट विशिष्टता, उत्प्रेरक गतिविधि और थर्मोस्टेबिलिटी शामिल हैं।

एनएडीपी+ में कमी वाले म्यूटेंट

तीन अलग-अलग बैक्टीरिया, ई. कोलाई, पी. पुटिडा, और सी. ग्लूटामिकम, को एनएडीपीएच-ऑक्सोट्रोफिक के रूप में इंजीनियर किया गया है, जिसका अर्थ है कि उन्हें विकास के लिए बहिर्जात एनएडीपीएच की आवश्यकता होती है। के मामले में ई. कोलाई और सी. ग्लूटामिकम, जब ग्लूकोज को कार्बन स्रोत के रूप में प्रदान किया गया था, तो एनएडीपी+ में कमी से बचने के लिए केंद्रीय चयापचय एंजाइमों को खटखटाया गया था, जबकि पी. पुटिडा में, सीआरआईएसपीआर/एनसीएएस9-सहायता प्राप्त इंजीनियरिंग का उपयोग रेडॉक्स चयापचय में उनकी भागीदारी को समझने के लिए लक्ष्य जीन के सेट को क्रमिक रूप से बाधित करने के लिए किया गया था। NADPH-ऑक्सोट्रोफिक उपभेदों का उपयोग तब कॉफ़ेक्टर विशिष्टता के आधार पर विकास-युग्मित एंजाइम इंजीनियरिंग के लिए किया गया था। उत्परिवर्तन का एक दौर ई. कोलाई का उपयोग करके अब तक का सबसे कुशल और विशिष्ट एनएडीपी+-निर्भर फॉर्मेट डिहाइड्रोजनेज प्राप्त हुआ, जबकि पी. पुटिडा और सी. ग्लूटामिकम अपनी प्रजातियों के पहले उपभेदों का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनका उपयोग इस प्रकार की इंजीनियरिंग के लिए किया जा सकता है।

म्यूटेंट की कमी NMN+ कमी

एनएमएन + में कमी के आधार पर कोफैक्टर साइक्लिंग और विकास को जोड़ने के लिए एक विकास-युग्मित चयन प्रणाली विकसित की गई थी। ई. कोलाई शफल स्ट्रेन का उपयोग किया गया था, जो कम ग्लूटाथियोन के उत्पादन में शामिल दो जीनों में विलोपन करता है। एक NMNH-निर्भर ग्लूटाथियोन रिडक्टेस प्रक्रिया को जोड़ने के लिए तर्कसंगत उत्परिवर्तन के माध्यम से विकसित किया गया था NMN+/NMNH साइक्लिंग, और एक NMN+-निर्भर ग्लूकोज डिहाइड्रोजनेज का उपयोग NMN+/NMNH कोफ़ेक्टर साइक्लिंग और इसलिए विकास का समर्थन करने के लिए किया गया था। अध्ययन में पहली बार ग्रोथ-कपल्ड एंजाइम इंजीनियरिंग के लिए गैर-कैनोनिकल रेडॉक्स कॉफैक्टर ऑक्सोट्रॉफी को भी लागू किया गया, जिसके परिणामस्वरूप इन विट्रो में बेहतर उत्प्रेरक दक्षता और अस्थायी स्थिरता के साथ थर्मोस्टेबल फॉस्फाइट डिहाइड्रोजनेज संस्करण तैयार हुआ। यह कार्य विकास-युग्मित एंजाइम इंजीनियरिंग के लिए एक उपयोगी तनाव प्रदान करता है, जो एनएमएन+/एनएमएनएच साइक्लिंग और गैर-विहित रेडॉक्स कोफ़ेक्टर की कम अवस्था के लिए ऑक्सोट्रोफिक पर निर्भर है।

रेडॉक्स कॉफ़ैक्टर्स के माध्यम से विकास-युग्मन की क्षमता ने बायोकैटलिस्ट को इंजीनियर करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में काम किया, विशेष रूप से टिकाऊ जैव उत्पादन के संदर्भ में। यद्यपि रेडॉक्स कॉफ़ेक्टर ऑक्सोट्रॉफिक उपभेदों की पीढ़ी में काफी प्रगति हुई है, बयान से पता चलता है कि अनुसंधान के लिए अभी भी कई अज्ञात रास्ते हैं। इनमें से एक में ई. कोलाई के अलावा अन्य जीवों के इंजीनियरिंग कॉफ़ेक्टर ऑक्सोट्रोफिक उपभेद शामिल हैं, जो विकास-युग्मित एंजाइम इंजीनियरिंग के लिए नई संभावनाएं खोल सकते हैं।

कुल मिलाकर, यह बताता है कि रेडॉक्स कोफैक्टर-आधारित विकास-युग्मन का उपयोग इंजीनियरिंग बायोकैटलिसिस के लिए एक प्रमुख अवसर का प्रतिनिधित्व करता है, विशेष रूप से उन उत्पादों के उत्पादन के लिए जो अन्य उच्च-थ्रूपुट एंजाइम इंजीनियरिंग दृष्टिकोणों की आवश्यकताओं को पूरा नहीं कर सकते हैं। यह टिकाऊ जैव उत्पादन के लिए अधिक बहुमुखी और कुशल जैव उत्प्रेरक विकसित करने की आवश्यकता पर जोर देता है और इस क्षेत्र में निरंतर अनुसंधान के महत्व को रेखांकित करता है।


संदर्भ: जोकेम आर. नीलसन ए, रूड ए. वेस्टहुइस बी, वेई ई. हुआंग ए, रेडॉक्स कॉफ़ेक्टर पुनर्जनन के हेरफेर के माध्यम से ग्रोथ-युग्मित एंजाइम इंजीनियरिंग, जैव प्रौद्योगिकी अग्रिम, 2023।